Рукокрылые распространены очень широко. Кроме тундры, приполярных районов и некоторых океанических островов они есть везде. Более многочисленны в тропиках. Рукокрылые являются эндемичными видами на многих океанических островах в отсутствие наземных млекопитающих, так как способны преодолевать большие расстояния над морем.
В фауне России насчитывается около 40 видов рукокрылых.
Размеры рукокрылых —2,5—40 см. Передние конечности превращены в крылья, но существенно иным образом, чем у птиц. Все пальцы «рук», кроме первого, у рукокрылых сильно удлинены и вместе с предплечьем и задними конечностями служат каркасом для кожной перепонки, образующей крыло. У большинства видов есть хвост, который обычно так-же охвачен летательной перепонкой. Перепонка пронизана сосудами, мышечными волокнами и нервами. Она может принимать существенное участие в газообмене рукокрылых, поскольку имеет значительную площадь и достаточно малый аэрогематический барьер. В холодную погоду рукокрылые могут заворачиваться в свои крылья, как в плащ.
Голова с широкой ротовой щелью, маленькими глазами и крупными, иногда сложно устроенными ушными раковинами. Волосяной покров густой, одноярусный. Кожная перепонка покрыта редкими волосками.
Зрение слабое и для ориентировки имеет малое значение. Слух исключительно тонкий. Диапазон слышимости огромный, в пределах от 12 до 190000 Герц.
Для ориентации в пространстве многие виды рукокрылых используют эхолокацию: издаваемые ими ультразвуковые импульсы отражаются от предметов и улавливаются ушными раковинами. Отражённые от препятствия ультразвуки воспринимаются органами слуха зверька, что и обеспечивает ориентировку в полёте ночью и добычу летающих насекомых.
Кроме ультразвука, летучие мыши пользуются и обычными звуковыми сигналами, в основном для общения. Эти звуки обычно лежат на пороге человеческого восприятия. Дети слышат цвирканье и писк большинства видов, пожилые люди — лишь немногих.
Все 1200 видов рукокрылых владеют тактикой приземления вниз головой.
Многие рукокрылые — ночные или сумеречные животные. Некоторые виды зимой впадают в спячку, другие мигрируют.
В период бодрствования обмен веществ идёт весьма интенсивно, и нередко за сутки летучие мыши съедают пищи по массе в размере, равном примерно массе собственного тела.
Питаются рукокрылые насекомыми (большинство летучих мышей насекомоядны, таких около 625 видов), фруктами (260 видов) или рыбой, разные виды специализируются на разной пище. Встречаются и хищники, питающиеся в основном мелкими позвоночными (птицами, грызунами, земноводными, рептилиями и рукокрылыми) — некоторые представители семейств копьеносых (Megadermatidae), щеломордых (Nycteridae) Старого Света и листоносых (Phyllostomidae) Нового Света. Иногда охотятся на мелкую рыбу и водных членистоногих отдельные виды семейств рыбоядных летучих мышей (Noctilionidae, Noctilio leporinus) и Гладконосые летучие мыши (Vespertilionidae, Myotis vivesi, Myotis adversus).
Американские вампиры из семейства Phyllostomidae (три вида из тропиков Нового Света) нападают на крупных животных, резцами срезают кусочки кожи и слизывают кровь. Например, кровью птиц питаются Diaemus youngi и Diphylla ecaudata, а кровью млекопитающих — Desmodus rotundus.
Чаще всего самка рождает только одного, голого и слепого детёныша. Иногда, пока детеныш ещё маленький, он летает с матерью на охоту, крепко уцепившись за её шерсть. Впрочем, этот способ скоро становится недоступным для них, потому что детёныши быстро растут.